Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford

Hàm lượng protein được ước lượng theo phương pháp Bradford

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue (CBB) liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch acid mạnh, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại ở 595 nm. Nhờ đó mà xác định được nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm CBB có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ.

Cơ chế phản ứng tạo màu trong phương pháp Bradford

Một số vấn đề khi phân tích Protein bằng thuốc thử Coomassie

Vấn đề	Nguyên nhân	Giải quyết
Mẫu trắng bình thường, nhưng mẫu chuẩn màu nhạt hơn	Lưu trữ thuốc thử không đúng Thuốc thử còn lạnh Đo màu ở bước sóng không chính xác	Lưu trữ lạnh thuốc thử Làm ấm về nhiệt độ phòng Đo ở bước sóng 595nm
Mẫu trắng và mẫu chuẩn bình thường, nhưng mẫu màu nhạt hơn	Phân tử lượng của protein quá nhỏ	Sử dụng phương pháp BCA/ Lowry
Xuất hiện kết tủa trong các ống nghiệm	Mẫu chứa các chất hoạt động bề mặt	Thẩm tích hoặc pha loãng mẫu Kết tủa protein bằng TCA, sau đó hòa tan kết tủa trong NaOH 50mM
Tất cả các ống xuất hiện màu xanh đen	Đệm có tính kiềm mạnh, hoặc pH thuốc thử tăng Thể tích mẫu quá lớn, pH tăng	Thẩm tích hoặc pha loãng mẫu
Cần đọc ở bước sóng khác	Thiết bị không có bộ lọc ở 595 nm	Có thể đọc tại bất cứ bước sóng nào từ 575-615nm

Ghi chú: Nồng độ đệm và muối, hóa chất sử dụng tối đa:

Tris (2M), Sodium acetate (180nM), NaCl (1M), Sodium citrate (200mM), Sodium phosphate (100mM), cystein (10mM), Mercaptoetanol (1M), EDTA (100mM), acetone (10%), EGTA (2mM), Ethanol (10%), HCl (100mM), NaOH (100 mM)

Tài liệu tham khảo:

C. M. Stoscheck, "Quantitation of protein," in Methods in Enzymology, vol. 182, M. P. Deutscher, Ed.: Academic Press, 1990, pp. 50-68.

J. E. Coligan, Current Protocols in Protein Science. Wiley, 1995.

 N. V. Mùi, Thực hành hóa sinh học. NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2007.

 M. M. Bradford, "A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding," Analytical Biochemistry, vol. 72, no. 1, pp. 248-254, 1976.

R. E. Wrolstad, Current Protocols in Food Analytical Chemistry (no. 1). Wiley, 2001.