Enzyme ficin và một số nghiên cứu

 Ficin (hay còn gọi là ficain) là enzyme thủy phân protein chính có trong nhựa cây sung, vả (Ficus).

Việc sử dụng nhựa sung vào nhiều mục đích khác nhau được nhắc đến từ lâu trong các tác phẩm lịch sử, văn học. Trong tác phẩm Iliad (khoảng 850 TCN), Homer nhắc đến việc sử dụng nhựa cây vả tây (F. carcia) mọc hoang để làm đông tụ sữa. Pedanius Dioscorides vào thế kỷ đầu tiên của kỷ nguyên Kitô giáo trích dẫn việc sử dụng nhựa vả tây của người Hy Lạp cổ làm thuốc nhuận tràng, chữa bệnh gout, phong cùi, động vật độc cắn, bệnh da, và làm đông tụ sữa. Trải qua nhiều thế kỷ, ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều loại bệnh tật được cho rằng đã giảm bớt hoặc chữa khỏi bởi quả vả/sung hoặc nhựa của chúng như sốt, phong, các vết thương, tiểu đường, chân bị nứt và viêm, và đau răng,....

Ở nhiều nơi trên thế giới nhựa của các loài thuộc chi Ficus còn được dùng để lấy cao su, bẫy chim, nhuộm baktik, làm nến, chất keo, sơn dầu, trị giun….

Quả vả tây/sung ngọt (Ficus carcia)

---

Ở Colombia, Venezuela và Trung Mĩ, Paraguay và Peru, nhựa họ sung/vả được gọi theo tên địa phương là “leche de higueron”,  “Leche de higueron branco” hoặc “leche de oje” và chúng thu được từ Ficus laurifolia Hort. ex Lam., Ficus glabrata HBK, Ficus anthelmintica Mart. -  hiện nay là Ficus insipida Wild.

Peckolt (1861) nghiên cứu nhựa của một số cây trong chi Ficus, đặc biệt là Ficus doliaria Mart, ông cho rằng đã tách được một “alkaloid” mà ông đặt tên là "doliarina" và pepsin thực vật mà ông đặt tên là "urostigma papayotin". Các nghiên cứu của Peckolt được tiếp tục bởi một số nhà nghiên cứu Brazil. Moncorvo (1881), một bác sĩ ở Rio, đã mô tả Ficus doliara (Ficus gameleira Standley) và hoạt động tiêu hóa của nhựa cây, mà ông gọi là “leite de gamelleira”. Nó có hoạt tính giống như là một loại thuốc giun với sự hiện diện của “doliarina”, tương tự như papain của đu đủ (Carica papaya L.).

Mussi (1890) đã kiểm tra các đặc tính tiêu hóa của nhựa Ficus carica L., xác định các đặc tính của enzyme mà ông gọi là “cradina” và phân biệt nó với pepsin và papain. Chadot và Rouge (1906) đã đặt tên “labferment” trong nhựa “sycochymase” và nhấn mạnh rằng nó là enzyme đông tụ lâu đời nhất được biết đến, đã được sử dụng ở Hy Lạp cổ đại để sản xuất phô mai.

Tên gọi “ficin” được đặt ra bởi Robbins vào năm 1930 cho một loại bột protein ông đã thu nhận từ cây vả tây (sung ngọt) thuộc chi Ficus. B.H. Robbins nhận thấy trong nhựa của cây thuộc chi Ficus có một loại enzyme có khả năng tiêu diệt được giun tròn Ascaris.

Năm 1961, ficin được chính thức đưa vào Hệ thống phân loại enzyme quốc tế với mã số là EC 3.4.4.12 (Enzyme thủy phân – Thủy phân liên kết peptide (Peptidase) – Peptidyl peptide hydrolase). Đến năm 1972 ficin được mã hóa lại, thành EC 3.4.22.3 (Enzyme thủy phân – Thủy phân liên kết peptide (Peptidase) – Cysteine endopeptidase).

Nhiều nghiên cứu về nhóm enzyme thủy phân protein trong họ Ficus đã chứng minh rằng trong Ficus không chỉ có cysteine protease mà còn có cả aspartic protease và serine protease.

Các nghiên cứu

Năm 1939, Walti là người đầu tiên thu nhận được enzyme ficin từ nhựa cây sung ngọt bằng phương pháp kết tinh trực tiếp.

Robbins và Lamson (1934) đã khảo sát phân bố của enzyme có hoạt tính thủy phân protein này giữa các loài thuộc chi Ficus. Ông đã tìm thấy sự khác biệt rất lớn từ loài này đến loài khác, cũng như về hàm lượng theo mùa ở nhựa Ficus carica ở Hoa Kỳ.

Williams và Whitaker (1969) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch ficin từ nhựa Ficus glabrata thu được 6 dạng phân tử ficin.

Jones và Glazer (1969) nghiên cứu tinh sạch ficin từ chế phẩm thương mại của nhựa cây Ficus glabrata thu được 5 dạng phân tử ficin có khối lượng phân tử 25.000-26.000 Da.

Sugiura và Sasaki (1974) đã nghiên cứu về protease có chứa đường thu nhận từ Ficus carica var. Huiraishi. Protein chứa đường (Ficin S, EC 3.4.4.12), từ Ficus carica var. Huiraishi, được tinh sạch bằng CM-cellulose và CM-Sephadex C-50 và kết tinh. Nó được xác định là Ficin S tinh khiết khi điện di. Hàm lượng đường trong Ficin S được xác định là 4,8%. Trọng lượng phân tử 2,6x10⁴ đối với Ficin S thu được bằng điện di SDS-PAGE (gel sodium dodecyl-sulfate-polyacrylamide). Enzyme hoạt động mạnh nhất ở pH 8,0 và 60°C, và ổn định trong một khoảng pH 2,0-8,0 ở 4°C trong 20 giờ và dưới 60°C trong 30 phút. Enzyme được hoạt hóa bởi cysteine và mercaptoethanol, nhưng bị ức chế hoàn toàn bởi HgCl₂ và p-chloromercuribenzoat. Các tính chất của ficin S đã được so sánh với các enzymeficin khác là ficin A, B, C và D từ Ficus carica var. Hōraishi. Kết quả này cho thấy ficin S chỉ khác điểm đẳng điện và hàm lượng đường so với ficin A, B, C và D.

Lynn và Clevette-Radford (1986) thu nhận một loại serine protease từ đa búp đỏ Ficus elastic và đặt tên là ficin E. Ficin E có khối lượng phân tử vào khoảng 50 KDa, điểm đẳng điện 3,7 và pHotp 6,0 đối với casein.

Williamsvà cộng sự (1986), nghiên cứu hoạt tính protease của 46 loài thuộc chi Ficus ở các vùng khác nhau trên thế giới.

Nassar và cộng sự (1987) nghiên cứu thu nhận ficin trong môi trường nuôi cấy mô Ficus carcia. Mô sẹo được lấy từ thân cây Ficus carcia cho thấy có chứa một lượng nhỏ ficin. Hàm lượng ficin trong mô sẹo cho thấy sự thay đổi theo thành phần hormon của môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên hoạt tính protease trong mô sẹo có tính chất khác với ficin thương mại. Khi khảo sát ảnh hưởng của iodoacetamide với nhựa cây và dịch chiết từ mô sẹo cho thấy hoạt tính protease bị ảnh hưởng đối với mẫu nhựa cây, còn dịch chiết thì không. Ngoài ra pH và nhiệt độ tối thích của mẫu thu từ nhựa cây là 7,0 và  66-77^oC, còn đối với dịch chiết mô sẹo là 8,0 và 47^oC. Sau đó, Cormier và cộng sự (1989) cũng tiến hành nghiên cứu tinh sạch một phần và khảo sát các đặc tính của ficin từ việc nuôi cấy mô sẹo của Ficus carcia.

Birgul Akar và cộng sự (1999) nghiên cứu sản xuất “Teleme” (một loại phô mai) nhờ enzyme ficin. Kết quả nghiên cứu cho thấy Teleme sản xuất nhờ ficin đã tinh sạch có các tính chất cảm quan và hóa học tốt hơn hẳn so với đối chứng từ nhựa thân.

Ficin thể hiện tính chất “molten globule” trong điều kiện acid ở pH từ 1,4 đến 2,0 (là trạng thái kích thước nhỏ hơn dạng mở xác định được bằng sắc kí lọc gel). 

Devaraj và cộng sự (2008), Nghiên cứu các đặc tính của ficin ở loài sung Ficus racemosa L. Enzyme được tinh sạch là một chuỗi polypeptide đơn có trọng lượng phân tử 44.500 ± 500 Da được xác định bằng MALDI-TOF. Enzyme có dãy pH giữa pH 4,5-6,5 và hoạt độ tối đa ở 60 ± 0,5^oC. Hoạt tính của enzyme đã được ức chế hoàn toàn bởi pepstatin-A cho thấy enzyme tinh khiết là một aspartic protease. Phổ hồng ngoại lưỡng cực Far-UV cho thấy enzyme tinh khiết chứa cấu trúc b là chủ yếu. Protease đã được tinh chế có thể chịu nhiệt. Nhiệt độ bất hoạt trung bình là 70 ± 0,5°C. Nhiệt bất hoạt theo động học đầu tiên ở pH 5,5. Năng lượng hoạt hóa (Ea) là 44,0 ± 0,3 kcal/mol. Enthalpy hoạt hóa(DH*), thay đổi năng lượng tự do (DG *) và entropy (DS *) được ước tính là 43 ± 4 kcal/mol, -26 ± 3 kcal/mol và 204 ± 10 cal/mol.K, tương ứng. Nghiên cứu enzyme bằng cách sử dụng chuỗi β oxy hóa  của insulin chỉ thị rằng protease này tốt nhất là thủy phân các liên kết peptid C-terminal là glutamate, leucine và phenylalanine.

Devaraj và cộng sự (2008) nghiên cứu tinh sạch, tính chất, ảnh hưởng của dung môi đến sự bền nhiệt của Ficin từ Ficus carica. Ficin được tinh sạch từ ficin thương mại bằng SDS-PAGE, lọc gel. Khối lượng phân tử vào khoảng 23,1±0,3 kDa được xác định bằng MALDI-TOF. Enzyme hoạt động trong khoảng pH 6,5-8, pH_otp 7,0. Enzyme này chứa ba liên kết disulfide và một gốc cysteine ở trung tâm hoạt động. Hiệu quả của các đồng dung môi đến độ bền nhiệt của enzyme như sorbitol, trehalose, sucrose, và xylitol cũng được khảo sát. Nhiệt độ biến tính khả kiến (Tm) của ficin tăng khi có mặt các đồng dung môi so với mẫu đối chứng (Tm = 72^oC). Hiệu quả bền nhiệt tối đa quan sát được khi có mặt trehalose.

Mohamed Azarkan và cộng sự (2011) nghiên cứu tính chất, sự Thiol-pegyl hóa chọn lọc và tinh sạch 5 đồng phân của Ficin từ nhựa Ficus carcia.

Hamid Zare và cộng sự (2013) nghiên cứu tinh sạch và sự tự phân của các đồng phân ficin từ nhựa sung ngọt (Ficus carica cv. Sabz). Tất cả các dạng ficin đều dễ tự phân trong điều kiện lưu trữ ở nhiệt độ cao, ngược lại, chỉ có hai loại ficin B,C là dễ bị tự phân ở nhiệt độ lạnh trong khi lưu trữ.

M. Gagaoua và cộng sự (2014) đã báo cáo rằng phương pháp phân riêng ba pha (TPP, dùng t-butanol và ammonium sulfate để kết tủa enzyme) là phương pháp hiệu quả để thu nhận và tinh sạch ficin từ nhựa cây Ficus carica L..

Volant và cộng sự (2015) đã nghiên cứu thu nhận một dạng ficin mới được đặt tên là ficin E, được tinh sạch từ nhựa cây vả tây Ficus carica bằng cách kết hợp sắc ký trao đổi cation với SP-Sepharose Fast Flow, Thiopropyl Sepharose 4B và sắc kí lọc gel FPLC. Trọng lượng phân tử được tìm thấy là (24,294 ± 10 Da) bằng phương pháp khối phổ, thấp hơn trọng lượng được quan sát trên SDS-PAGE (khoảng 27 kDa). Dữ liệu Far-UV CD cho thấy cấu trúc bậc hai gồm 22% xoắn alpha và 26% gấp nếp beta. Phân tích carbohydrate cho thấy protein này không được glycosyl hoá.  pH và nhiệt độ tối ưu ở pH 6,0 và 50°C. So sánh với các ficin được biết đến A, B, C, D1 và D2 cho thấy ficin E có hoạt tính như ficin A đối với hai cơ chất tạo màu, trong khi nó giống như các chất D1 và D2 đối với ba cơ chất phát huỳnh quang. Hoạt tính enzyme của ficin E không bị ảnh hưởng bởi Mg²⁺, Ca²⁺ và Mn²⁺ ở nồng độ lên đến 10 mM. Tuy nhiên, hoạt tính này đã bị ức chế hoàn toàn bởi Zn²⁺ ở nồng độ 1 mM. Các kiểm tra sự kìm hãm hoạt tính đã khẳng định rằng đây là một cysteine protease, không bị ảnh hưởng bởi chất tổng hợp (Pefabloc SC, benzamidine) và chất ức chế protein tự nhiên (aprotinin) cho serine protease, hay bởi các chất ức chế protease aspartic (pepstatin A) và các chất ức chế metallo-proteases (EDTA, EGTA). Mặt khác, nó đã bị ảnh hưởng bởi chất ức chế metallo-protease o-phenanthroline. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme bị mất hoàn toàn bởi các chất ức chế cysteine protein (E-64, iodoacetamide), bởi các hợp chất khóa thiol (HgCl₂) và các chất ức chế cysteine/serine protein (TLCK và TPCK).

Mnif IH và cộng sự (2015) nghiên cứu thu nhận một loại cysteine protease mới từ nhựa của cây Gừa (Ficus microcarpa) bằng cách kết tủa protein ở 20-40% acetone, lọc gel Sephadex G75 và sắc kí Mono Q-Sephinose FF. Khối lượng phân tử ước tính khoảng 20 kDa bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. Enzyme được tinh sạch có hoạt tính tối đa tại pH 8 và nhiệt độ 70^oC.

Hamid Zare và cộng sự (2016) nghiên cứu kiểm soát sự tự phân và thay đổi cấu trúc của ficin khi có mặt hai chất ức chế là iodoacetamide và tetrathionate. Kết quả cho thấy rằng iodoacetamide hoàn toàn ngăn chặn sự tự phân, tuy nhiên sự kết tụ lại diễn ra mạnh. Do nếp gấp beta tăng trong cấu trúc bậc hai, khi cấu trúc mở, các phân tử ficin có xu hướng lại gần nhau gây ra kết tụ. Iodoacetamide ức chế hoàn toàn hoạt tính ficin không thuận nghịch và làm kết tụ lượng lớn protein. Trong khi đó, tetrathionate ức chế một phần sự tự phân mà ít ảnh hưởng xấu đến sự mở cấu trúc và hiệu quả ức chế ficin có thể phục hồi sau thẩm tích.

YufangYang và cộng sự (2017) nghiên cứu cho thấy ficin có hoạt tính tương tự peroxidase. Ficin có thể chuyển các cơ chất peroxidase thành sản phẩm có màu khi có mặt H₂O₂. Các kết quả nghiên cứu cho thấy trung tâm hoạt động tương tự peroxidase của ficin khác với protease, điều này cho thấy rằng một loại enzyme có khả năng xúc tác nhiều hơn 1 loại cơ chất để có những loại phản ứng khác nhau .

Ahmad Homaei và cộng sự (2017) nghiên cứu tinh sạch, đặc tính xúc tác, động học và nhiệt động học của một loại ficin mới từ Ficus johannis. Ficin được tinh sạch qua các bước: kết tủa bằng amonium sulfate, sắc kí CM-Sepharose và SP-Sepharose, lọc gel Sephadex G-25. Enzyme có khối lượng phân tử 25kDa, pH_opt 7,0 và T_opt = 60^oC đối với cơ chất Casein. Tốc độ thủy phân theo phương trình Michaelis-Menten: k_cat=32,9 s^-1 và K_m là 13,7 mM.

Baidamshina và cộng sự (2017) tiến hành khảo sát sự phá hủy lớp màng sinh học bên ngoài vi khuẩn, trên Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis bằng ficin. Độ dày của màng sinh học giảm 2 lần khi xử lý bằng ficin 10mg/ml và 6 lần khi xử lý bằng ficin 1000mg/ml.

Sri Wahyuni và cộng sự (2017) thu nhận ficin từ  cây sung bọng (Ficus septica), xác định ficin từ loài này có pH_opt 6-8 và t_opt =60^oC.

Các kết quả nghiên cứu của Sakihito Kitajima và cộng sự (2018) cho thấy có sự khác biệt về sự phân bố giữa các dạng ficin trong các bộ phận (quả sống, cuống lá, thân) của loài sung ngọt F. carcia. Kết quả nghiên cứu cho thấy các dạng ficin phân bố nhiều nhất trong nhựa quả, còn trong thân có hàm lượng protein cao nhất, trong khi đó cuống lá chứa nhiều chất ức chế Trypsin.

Andrea S Rojas-Mercado và cộng sự (2018) nghiên cứu vi bao và cố định dịch chiết ficin trong các sợi nano electrospun. Ficin được cố định có pH_opt 8, còn dịch chiết là pH_opt 7. Enzyme được cố định theo phương pháp này có thể tái sử dụng đến 9 lần.

Tài liệu tham khảo:

1.       E. R. L. Gaughran, "Ficin: History and Present Status," Quarterly Journal of Crude Drug Research, vol. 14, no. 1, pp. 1-21, 1976.

2.       T. Peckolt, "Ueber den Milchsaft von Ficus sylvestris St. Hilaire und Ficus doliaria Mart," Archiv der Pharmazie, vol. 155, no. 1, pp. 31-43, 1861.

3.       B. H. Robbins, "A Proteolytic Enzyme in Ficin, the Anthel-mintic Principle of Leche de Higueron," Journal of Biological Chemistry, vol. 87, no. 2, pp. 251-257 pp., 1930.

4.       K. B. Devaraj et al., "An unusual thermostable aspartic protease from the latex of Ficus racemosa (L.)," Phytochemistry, vol. 69, no. 3, pp. 647-655, 2008.

5.       K. R. Lynn and N. A. Clevette-Radford, "Ficin E, a serine-centred protease from Ficus elastica," Phytochemistry, vol. 25, no. 7, pp. 1559-1561, 1986.

6.       E. Liener and B. Friedenson, "Ficin," in Methods in Enzymology, vol. 19: Academic Press, 1970, pp. 261-273.

7.       P. T. Englund et al., "Ficin. I. Its isolation and characterization," Biochemistry, vol. 7, no. 1, pp. 163-175, 1968.

8.       G. B. Marini-Bettolo et al., "Research on ficin. I. Purification, characterization and amino acid composition," Annali dell'Istituto Superiore di Sanità, vol. 1, no. 1, pp. 244-56, 1965. Ricerche sulla ficina. I. Purificazione, caratterizzazione e composizione in amminoacidi.

9.       R. M. Metrione et al., "Purification, partial characterization, and sequence around a reactive sulfhydryl of ficin," Archives of biochemistry and biophysics, vol. 122, no. 1, pp. 137-143, 1967.

10.   N. R. Gould and I. E. Liener, "Reaction of ficin with diisopropylphosphorofluoridate. Evidence for a contaminating inhibitor," Biochemistry, vol. 4, pp. 90-8, 1965.

11.   N. Đ. Lượng, Công nghệ enzyme. NXB Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh, 2004.

12.   J. R. Whitaker, Principles of Enzymology for the Food Sciences, Second Edition. Taylor & Francis, 1993.

13.   R. C. Wong and I. E. Liener, "Amino acid sequence involving the reactive thiol group of ficin," Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 17, no. 5, pp. 470-474, 1964.

14.   Light et al., "Current status of the structure of papain: the linear sequence, active sulfhydryl group, and the disulfide bridges," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 52, no. 5, p. 1276, 1964.

15.   S. S. Husain and G. Lowe, "The amino acid sequence around the active-site cysteine and histidine residues, and the buried cysteine residue in ficin," The Biochemical journal, vol. 117, no. 2, pp. 333-340, 1970.

16.   H. Mnif et al., "A cysteine protease isolated from the latex of Ficus microcarpa: purification and biochemical characterization," Biotechnology and Applied Biochemistry, vol. 175, no. 3, pp. 1732-44, 2015.

17.   Ficin A [Online]. Available: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A182DW06

18.   Ficin 3 [Online]. Available: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2Z6DRN1

19.   Ficin D [Online]. Available: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A182DW11

20.   Ficin 4 [Online]. Available: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A2Z6DRL6

21.   D. Schomburg and M. Salzmann, Enzyme Handbook. Springer Berlin Heidelberg, 1991.

22.   M. Sugiura and M. Sasaki, "Studies on proteinases from Ficus carica var. Horaishi. V. Purification and properties of a sugar-containing proteinase (ficin S)," Biochimica et Biophysica Acta, vol. 350, no. 1, pp. 38-47, 1974.

23.   S. A. Bernhard and H. Gutfreund, "Ficin catalysed reactions: the affinity of ficin for some arginine derivatives," The Biochemical journal, vol. 63, no. 1, pp. 61-64, 1956.

24.   D. E. Kramer and J. R. Whitaker, "Ficus enzymes II. Properties of the proteolytic enzymes from the latex of Ficus carica variety Kadota," Journal of Biological Chemistry, vol. 239, no. 7, pp. 2178-2183, 1964.

25.   J. R. Whitaker, "Properties of the proteolytic enzymes of commercial ficin," Journal of Food Science, vol. 22, no. 5, pp. 483-493, 1957.

26.   T. Sanner and A. Pihl, "Studies on the active -SH group of papain and on the mechanism of papain activation by thiols," Journal of Biological Chemistry, vol. 238, pp. 165-71, 1963.

27.   J. R. Whitaker, "Assay and properties of commercial ficin," Journal of Food Science, vol. 22, no. 5, pp. 468-478, 1957.

28.   S. Fadyloglu, "Immobilization and characterization of ficin," Nahrung, vol. 45, no. 2, pp. 143-6, 2001.

29.   (22/04). Ficus. Available: www.theplantlist.org/1.1/browse/A/Moraceae/Ficus/#statistics

30.   D. S. Eldemery and K. Abdellatif, Assessments of biodiversity of ornamental Ficus species based on EST markers and morphological traits. 2014, pp. 932-938.

31.   L. Đ. Mỡi et al., Tài nguyên thực vật Việt Nam - Những cây chứa các hợp chất sinh học. NXB Nông nghiệp, 2005.

32.   H. Zare et al., "Purification and autolysis of the ficin isoforms from fig (Ficus carica cv. Sabz) latex," Phytochemistry, vol. 87, pp. 16-22, 2013.

33.   E. P. Lansky and H. M. Paavilainen, Figs: The Genus Ficus. CRC Press, 2010.

34.   W. Alphonse, "Process for producing proteolytic enzyme from ficus latex," ed: Google Patents, 1939.

35.   H. R. Benjamin, "Proteolytic Enzyme in the Latex from the Fig Tree (Ficus Glabrata). The pH of Optimal Activity," Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, vol. 32, no. 6, pp. 894-896, 1935.

36.   H. R. Benjamin, "Proteolytic Enzyme Content of Latex from the Fig Tree (Ficus carica L). Seasonal Variation," Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, vol. 32, no. 6, pp. 892-893, 1935.

37.   D. C. Williams and J. R. Whitaker, "Multiple Molecular Forms of Ficus glabrata Ficin. Their Separation and Relative Physical, Chemical, and Enzymatic Properties," Plant Physiology, vol. 44, no. 11, pp. 1574-83, 1969.

38.   K. Jones and A. N. Glazer, "Comparative studies on four sulfhydryl endopeptidases ("ficins") of Ficus glabrata latex," The Journal of Biological Chemistry, vol. 245, no. 11, pp. 2765-72, 1970.

39.   D. C. Williams et al., "Proteolytic activity in the genus ficus," Plant Physiology, vol. 43, no. 7, pp. 1083-1088, 1968.

40.   H. Nassar and H. J. Newbury, "Ficin Production by Callus Cultures of Ficus carica," Journal of Plant Physiology, vol. 131, no. 3, pp. 171-179, 1987.

41.   F. Cormier et al., Partial purification and properties of proteases from fig (Ficus carica) callus cultures. 1989, pp. 797-802.

42.   B. Akar and S. Fadiloglu, Teleme production by purified ficin. 1999, pp. 671-680.

43.   K. B. Devaraj et al., "Characterization of acid-induced molten globule like state of ficin," International Journal of Biological Macromolecules, vol. 45, no. 3, pp. 248-54, 2009.

44.   K. B. Devaraj et al., "Purification, characterization, and solvent-induced thermal stabilization of ficin from Ficus carica," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, no. 23, pp. 11417-23, 2008.

45.   M. Azarkan et al., "Selective and reversible thiol-pegylation, an effective approach for purification and characterization of five fully active ficin (iso)forms from Ficus carica latex," Phytochemistry, vol. 72, no. 14-15, pp. 1718-31, 2011.

46.   D. Baeyens-Volant et al., "A novel form of ficin from Ficus carica latex: Purification and characterization," Phytochemistry, vol. 117, pp. 154-67, 2015.

47.   H. Zare et al., "Autolysis control and structural changes of purified ficin from Iranian fig latex with synthetic inhibitors," International Journal of Biological Macromolecules, vol. 84, pp. 464-71, 2016.

48.   Y. Yang et al., "Intrinsic Peroxidase-like Activity of Ficin," Scientific reports, vol. 7, pp. 43141-43141, 2017.

49.   Homaei et al., "Purification, catalytic, kinetic and thermodynamic characteristics of a novel ficin from Ficus johannis," Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, vol. 10, pp. 360-366, 2017.

50.   D. R. Baidamshina et al., "Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease," Scientific Reports, vol. 7, p. 46068, 2017.

51.   T. Wahyuni et al., Isolation and characterization of ficin enzyme from Ficus septica Burm F stem latex. 2017, p. 161.

52.   S. Kitajima et al., "Comparative multi-omics analysis reveals diverse latex-based defense strategies against pests among latex-producing organs of the fig tree (Ficus carica)," Planta, vol. 247, no. 6, pp. 1423-1438, 2018.

53.   S. Rojas-Mercado et al., "Encapsulation and immobilization of ficin extract in electrospun polymeric nanofibers," International Journal of Biological Macromolecules, vol. 118, no. Pt B, pp. 2287-2295, 2018.

54.   N. Đ. Nghiệp, "Thu nhận, khảo sát một số đặc tính và ứng dụng của enzym ficin từ cây sung giống Ficus," Master, Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh, 2002.

55.   V. V. Q. Bảo et al., "Khảo sát điều kiện thu nhận chế phẩm protease từ quả vả (Ficus auriculata L.) ", Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp, vol. 1, no. 2, 2017.

56.   R. J. Whitehurst and M. Van Oort, Enzymes in Food Technology. Wiley, 2009.

57.   R. Ramezani et al., "Effect of Chemically Modified Soy Proteins and Ficin-tenderized Meat on the Quality Attributes of Sausage," Journal of Food Science, vol. 68, no. 1, pp. 85-88, 2003.

58.   C. Mazri et al., Characterization and Application of Phytochemicals Substances of the Fig Tree: Biological and Sensory Characterization of Ficin and Cheeses “Fresh and Soft”. 2018, pp. 71-78.

59.   W. S. A. Aoyagi, History of Research on Soy Proteins - Their Properties, Detection in Mixtures, Soy Molasses, etc. (1845-2016): Extensively Annotated Bibliography and Sourcebook. Soyinfo Center, 2016.

60.   W. Hardwick, Handbook of Brewing. CRC Press, 1994.

61.   J. R. Whitaker, Principles of Enzymology for the Food Sciences, Second ed. Taylor & Francis, 1993.

62.   P. S. Taoukis et al., "Inhibition of shrimp melanosis (black spot) by ficin," Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, vol. 23, no. 1, pp. 52-54, 1990.

63.   J. W. Yao et al., "Effectiveness of cysteine proteases on protein/pigment film removal," Archives of Oral Biology, vol. 58, no. 11, pp. 1618-26, 2013.

64.   B. Raskovic et al., "Identification, purification and characterization of a novel collagenolytic serine protease from fig (Ficus carica var. Brown Turkey) latex," J Biosci Bioeng, vol. 118, no. 6, pp. 622-7, 2014.

65.   M. Gagaoua et al., "Three-phase partitioning as an efficient method for the purification and recovery of ficin from Mediterranean fig (Ficus carica L.) latex," Separation and Purification Technology, vol. 132, pp. 461-467, 2014.

66.   Homaei et al., "Purification, catalytic, kinetic and thermodynamic characteristics of a novel ficin from Ficus johannis," Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, vol. 10, no. Supplement C, pp. 360-366, 2017.

67.   E. Liener, "A study of the number and reactivity of the sulfhydryl groups of ficin," Biochimica et Biophysica Acta, vol. 53, no. 2, pp. 332-342, 1961.